Obtención de animales transgénicos

BOREAS  NATURAL

Dra. Rosario Osta
Laboratorio de Genética Bioquímica y Grupos Sanguíneos
Facultad de Veterinaria Universidad de Zaragoza

1- Introducción
2- Transgénesis al azar
3- Recombinación homóloga o transgénesis dirigida
4- Bibliografía

Resumen

En el siguiente artículo se pretende mostrar de una forma simplificada alguno de los métodos utilizados en la obtención de animales transgénicos. En la primera parte nos referiremos a la creación mediante transgénesis al azar en el que no se controla el lugar de inserción del transgén en el genoma. La segunda parte hablaremos de la recombinación homóloga o también llamada mutagénesis dirigida, en la que se controla el lugar de inserción. Por último, veremos de forma esquemática las aplicaciones que se barajan como interesantes.

Palabras-clave: transgénesis, animal transgénico, recombinación homóloga, transgénesis dirigida

1- INTRODUCCIÓN: ¿QUÉ ES UN ANIMAL TRANSGÉNICO?

Desde que en 1982 el Dr. Palmiter en la revista Nature, ofreció la imagen del primer ratón transgénico que conmocionó al mundo científico los estudios sobre este tema han sido muy numerosos. Las aplicaciones de los animales transgénicos poseen una dificil clasificación y abarcan numerosos campos. Se podría hablar de dos grandes áreas de aplicación, las que servirían para investigación básica y médica (donde el animal de elección debido al coste económico y tiempo es el ratón) y las que tendrían un efecto directo sobre la producción y sanidad animal (especies domésticas). Pero ante todo tendremos que definir ¿qué es un animal transgénico?

Un animal transgénico es aquel al que se ha introducido un gen exógeno a fin de mejorar o cambiar caracteres existentes o introducir nuevos y que es capaz de transmitir a su descendencia.

A pesar de que los métodos de obtención son numerosos, todos ellos tienen unas fases comunes que pasamos a enumerar .En primer lugar, elegir y aislar el gen deseado de células normales y clonarlo. Posteriormente, purificar el fragmento deseado o insertarlo en un vector para introducirlo en el interior de las células receptivas. Una vez en el interior, hay que conseguir que el gen actúe correctamente, es decir, en puntos no dañinos de inserción y que se exprese y de lugar al producto génico deseado. Por último, estos genes introducidos deben transmitirse en cada generación celular y por supuesto a la descendencia. Nos encontramos pues, con una tecnología muy compleja que se ha desarrollado, basada sobretodo en dos grandes campos científicos, la genética y la reproducción (Pintado y Gutiérrez, 1991).

2- TRANSGÉNESIS AL AZAR

Como ya hemos explicado antes este tipo de transgénesis consiste en la incorporación del transgén al DNA de una forma aleatoria. En primer lugar, deberemos realizar la elección del transgén, lo que supone un conocimiento completo del mismo, tanto de su parte estructural (el producto que expresará) como de su parte reguladora (marcará el cómo, dónde y cuando se expresará), ambas partes pueden ser de la propia especie o diferente. Un ejemplo de esta construcción puede observarse en la Figura l. Así pues, es tan o más importante la elección del producto génico como la regulación del mismo. A pesar de los grandes avances científicos, todavía hoy son necesarios más estudios a nivel básico para poder llegar a entender como funcionan los diferentes genes y sus reguladores.


Figura 1.- Construcción genética (transgén) utilizada en transgénesis al azar

Respecto a los métodos para introducir ese transgén en el organismo han sido muy numerosos. Sin embargo, nos vamos a centrar en el que ha sido el más utilizado que es la microinyección en pronúcleos.

Tras la preparación de la construcción genética (transgén) se introduce una gran cantidad de ese material genético en el huevo, es decir, ya ha tenido lugar la unión de los gametos masculino y femenino, pero todavía no ha comenzado la division del embrión. La inyección del DNA se realiza normalemente en el pronucleo masculino. Como puede observarse en la Figura 2, para la realización de la experiencia se coloca el embrión en un microscopio invertido para con la ayuda de dos micropipetas, una con extremos redondeados que nos permitira sujetar el embrión y la otra con el estremo afilado que nos permitirá inyectar el DNA exógeno. 


Figura 2.- Inyección de DNA en un embrión de ratón

Los animales que nacen, tras la implantación de embriónes microinyectados en una madre adoptiva, serán analizados para conocer si han introducido el transgén en su genoma mediante técnicas de biología molecular. Si el transgén ha sido introducido y ademas los descendientes de este animal producen animales transgénicos acabamos de crear un transgénico.

Como ya se ha comentado antes esta es la técnica más utilizada para la creación de este tipo de animales. Sin embargo, también se han desarrollado otros métodos de los que pasamos a enumerar algunos:

  1. Métodos víricos, que son utilizados para animales en los que el huevo fecundado esta protegido, como por ejemplo, en aves. En este caso son los retrovirus en los que se ha eliminado el poder patógeno los utilizados como vectores. Utilizamos estos virus como una especie de autobús que será capaz de llevar el transgén al genoma.
  2. Método de bombardeo de partículas, en el que el transgén en el individuo adulto se introduce con ayuda de unos proyectiles impregnados en DNA. Es la llamada pistola de DNA, estos microproyectiles son partículas de tungsteno u oro que son disparadas mediante una bomba de helio. Este método ha tenido una mayor importancia en plantas debido a que el escaso poder de penetración del DNA ha sido un gran inconveniente para su utilización en animales.
  3. Otro de los métodos que resulta interesante es la introducción del transgén mediante espermatozoides. Este método se realizó con éxito por un grupo italiano hace algunos años, pero nunca volvio a repetirse por otros grupos de investigación, lo que lo descalifico como método de elección. Sin embargo, actualmente mediante la modificación de algunos parámetros parece barajarse como un método que en un futuro pueda dar resultados favorables.

Sin embargo y a pesar de que hasta el momento todos los animales transgénicos (excepto en el ratón, luego veremos por que) han sido desarrollados mediante esta tecnología, que el gen exógeno sea introducido en el genoma al azar posee muchos inconvenientes derivados del escaso control sobre la inserción del mismo. Así, pueden insertarse más de una copia y/o en zonas del genoma que no permitan la expresión del mismo y/o en genes que sean cruciales para la vida del embrión (existen determinados autores que hablan del 7-10%). Ante estos problemas resulta de gran interés el conseguir una metodología que permita controlar con mayor exactitud el lugar de integración del transgén. Esto fué logrado mediante el aislamiento de las células E.S. en ratón, en otras especies se intenta lograr mediante las experiencias de clonación.

3- RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA O TRANSGÉNESIS DIRIGIDA

 Como hemos comentado antes, esta metodología surgió para intentar dirigir el transgén a un lugar específico del genoma,eso es posible si el material genético es introducido en células en cultivo. La utilización de cultivos celulares para la manipulación genética presenta varias ventajas que intentaremos explicar: Es más fácil la introducción del DNA en el genoma (mayor accesibilidad), es posible seleccionar las células que nos interesen ya pueden estudiarse minuciosamente mediante técnicas de biología molecular. Dichas técnicas nos permitiran conocer donde, como y cuantas veces se ha introducido el gen exógeno.

Pero, ¿cómo de unas células en cultivo puede realizarse un individuo adulto?. Esta pregunta tuvo su respuesta tras el aislamiento de las células E.S. o totipotentes. Fueron aisladas por primera vez por Evans y Kaufman en 1981 y provienen de embriónes de ratón (en estadios tempranos, morulas o blastocistos, son embriónes de 2 y 3 días) . Lo interesante de este tipo de células es que introducidas en un embrión son capaces de llegar a formar parte de cualquier tejido del mismo entre ellos las células germinales primordiales y por tanto los gametos. Es decir modificando geneticamente estas células podemos modificar los gametos y por tanto la descendencia.

La construcción genética utilizada además de los genes de selección posee regiones homólogas (es decir idénticas secuencias de DNA) del lugar del genoma en el que queremos insertar el transgén. Al introducir la misma en las células, mediante estas zonas homólogas se realiza un intercambio con las de gen , introduciéndose en ese lugar la parte de la construcción no homóloga al resto. De este modo, la realización de esa experiencia se hace de una forma mucho más fina y localizada y es posible hacer llegar, como hemos comentado antes, el transgén a un lugar específico del genoma bajo el efecto de las regiones reguladoras que nos interesen. Esta experiencia se realiza en células en cultivo, no es posible realizarlas directamente en el embrión,por que es necesario una gran cantidad de DNA para realizar los estudios de selección de células correctamente modificadas.


Figura 3.- Esquema de la recombinacion
En este caso, la pipeta de inyección presenta una mayor apertura de forma que permita la recogida de dichas células. Por norma general suelen introducirse de 10 a 15 células en blastocistos siendo muy importante la aproximación de dichas células al botón embriónario del mismo, como puede observarse en la Figura 4.


Figura 4.- Microinyección de células ES en blastocisto de ratón

Hace algún tiempo y debido a la mejora de la calidad de las células totipotentes, se comenzó a realizar el método de agregación. La técnica consiste en co-cultivar dichas células con embriónes en estado de mórula (previa eliminación de la membrana pelúcida, que protege al embrión) para logra que exista la unión entre ellas y que el individuo que nace sea una mezcla de ambos tipos celulares.

Con cualquiera de los dos métodos se logra conseguir lo que se llama un animal quimera, facilmente detectable por que las células E.S. provienen de una línea de ratones de color marrón y el blatocisto utilizado es de color negro. Es decir la piel de los animales que hayan sido "colonizados" por las células E.S. poseerá dos colores tal como se observa en la Figura 5.


Figura 5.- Ratón quimérico donde se observan  los dos colores del animal en la piel

Lo necesario es que algunas de las células que formen la línea germinal (es decir, los espermatozoides) provengan de las ES y sean capaces de formar un individuo transgénico.Por tanto una vez obtenida la quimera es necesario cruzarla para obtener su descendencia y localizar el animal transgénico.

Como puede observarse, esta sería la forma de elección para la realización de animales transgénicos. Sin embargo, el problema existente para aplicar este tipo de metodología es la no existencia de estas células excepto para el ratón. A pesar de los numerosos esfuerzos realizados por conseguir llegar a aislar células totipotentes en otras especies no se llegó a conseguir.

Es aquí de nuevo donde debemos de hablar de la Oveja Dolly, conocida por todos. Pero, ¿Qué era lo que los investigadores del Roslin pretendían?. Como hemos tratado de explicar anteriormente, la posibilidad de tener células en cultivo para ser manipuladas era uno de sus grandes intereses cuando desarrollaban esta metodología.

En 1996 el equipo de Ian Wilmut, demostró como a partir de células de embrión eran capaces de crear un animal que provenía de estos clones (Campbell y cols, 1996). Este hecho significaba la posibilidad de tener células en cultivo para poder realizar una transgénesis mucho más fina mediante recombinación homologa. 

Pero, ¿para qué sirven los animales transgénicos?

Si tenemos en cuenta que el genoma humano esta casi acabado y es esperable que nos proporcione una gran información sobre las enfermedades genéticas, mutaciones que las producen, etc, la utilización de los animales transgénicos nos permitirá un mayor conocimiento de la función y regulación de los distintos genes. De este modo, una de las grandes utilidades es la creación de modelos experimentales de enfermedades humanas, de modo que los posibles tratamientos sean anteriormente testados en este tipo de animales. Ya existen modelos de ratón que desarrollan las patologías de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica, parkinson, diabetes,etc. que nos permitiran un conocimiento mas exhaustivo de las mismas y la búsqueda de posibles tratamientos.

Si hablamos de los animales transgénicos utilizados en producción animal podemos pensar en varios modos de actuación. Por un lado, la utilización de esta tecnología para intentar mejorar en calidad o cantidad los caracteres existentes o la introducción de nuevos caracteres en los organismos. Este tipo de metodología ha tenido un mayor desarrollo en los vegetales pero por el momento en los animales no ha sido desarrollada. En contra de lo que ocurre en vegetales, no existen productos alimenticios transgénicos de origen animal en el mercado.

Otra de las aplicaciones en la "producción animal" ha sido la utilización de los animales como bioreactores, es decir, la producción de proteínas de interés en estos animales que hasta ahora se viene realizando en bacterias o cultivos celulares. Es lo que se denomina "Granjas biotecnológicas" o Biotecnología de Corral y que esta teniendo un gran desarrollo en los últimos años. El equipo pionero en este tipo de metodología fué el Dr. Wilmut en el Instituto Roslin que inicio sus estudios en 1989. Este es el caso de la oveja "Tracy", el animal producía en la leche 30 gr./litro de alpha-l-antitripsina, fármaco utilizado en el tratamiento de fibrosis quística humana. Esta proteína producida por el animal se encuentra en fase de estudio y es esperable que pueda utilizarse como fármaco en un breve espacio de tiempo. El problema se planteó cuando las hijas de esta oveja a pesar de continuar la producción de dicha proteína en la leche esta estaba muy disminuida. Aquí, de nuevo debemos de hablar de la oveja Dolly, ya que contrariamente a lo que la opinion pública piensa, cuando el Dr. Wilmut intentó llevar a cabo esta técnica no era solamente para producir clones de animales altamente seleccionados si no clonar animales transgénicos que produzcan sustancias terapéuticas en su leche. Sin embargo, y contrariamente a lo que se opina, esta metodología no está ni mucho menos desarrollada totalmente, seran necesarios futuros estudios que permitan tener un conocimiento más completo de todos estos procesos.

4- BIBLIOGRAFÍA

Campbell, K.H.S.; McWhir, J., Ritchie, W.A. and Wilmut, I.(1996). Nature, 380, 64-66.

Pintado, B. y Gutierrez, A(1991). XIV Curso internacional de Reproducción Animal. Madrid.

Evans, M.J. y Kaufman, M. H. (1981). Nature, 292,154-156.

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